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實(shí)驗(yàn)提取質(zhì)粒DNA方法
點(diǎn)擊次數(shù):1521 更新時(shí)間:2019-12-27

提取質(zhì)粒DNA的方法有很多種,從提取產(chǎn)量上分可分為微量提取、中量提取、大量提取,從使用儀器上分可分為一般提取和試劑盒方法提取,從具體操作方法分可以分為堿裂解法、煮沸法、牙簽法等,各種不同的方法各有其優(yōu)缺點(diǎn),根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康目梢圆捎煤线m的提取方法。

堿裂解法:人們使用堿與SDS裂解法從E. coli(大腸桿菌)中分離制備質(zhì)粒DNA已有30多年的歷史。將細(xì)菌懸浮液暴露于高pH值的強(qiáng)陰離子洗滌劑中,會(huì)使細(xì)胞壁破裂,染色體DNA和蛋白質(zhì)變性,將質(zhì)粒DNA釋放到上清中。盡管堿性溶劑使堿基配對(duì)*破壞,閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雙鏈仍不會(huì)彼此分離,這因?yàn)樗鼈冊(cè)谕負(fù)鋵W(xué)上是相互纏繞的。只要OH-處理的強(qiáng)度和時(shí)間不要太過,當(dāng)pH值恢復(fù)到中性時(shí),DNA雙鏈就會(huì)再次形成。

質(zhì)粒DNA煮沸法:是將細(xì)菌懸浮于含有Triton X-100和能消化細(xì)胞壁的溶菌酶的緩沖液中,然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細(xì)菌外壁,還有助于解開DNA鏈的堿基配對(duì),并使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。但是。閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈彼此不會(huì)分離,這是因?yàn)樗鼈兊牧姿岫ス羌芫哂谢ハ嗬p繞的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。當(dāng)溫度下降后,閉環(huán)DNA的堿基又各就各位,形成超螺旋分子,離心除去變性的染色體DNA和蛋白質(zhì),就可從上清中回收質(zhì)粒DNA。煮沸裂解法對(duì)于小于15kb的小質(zhì)粒很有效,可用于提取步至lmL(小量制備),多至250mL(大量制備)菌液的質(zhì)粒,并且對(duì)大多數(shù)的大腸桿菌菌株都適用。
質(zhì)粒小提試劑盒:用于大腸桿菌中質(zhì)粒DNA的小量提取,它結(jié)合了優(yōu)化的堿裂解法,以及方便快捷的硅膜離心技術(shù),具有高效,快捷的特點(diǎn),能在30min內(nèi)完成全部操作。利用試劑盒能從1-5mL過夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液中純化得到10-40μg高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA(OD260/OD280=1.7-1.9),此質(zhì)粒DNA可直接用于DNA序列分析,各種酶促反應(yīng),PCR以及部分細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染等。

 

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